近日，我所生物技术研究部分子探针与荧光成像研究组（1818组）徐兆超研究员、乔庆龙副研究员团队发现，脂水分配系数——Clog P决定了荧光染料对脂滴（LD）的染色性能，Clog P值在2.5到4之间的荧光染料可以在脂滴外部形成缓冲池，取代脂滴内的光漂白染料，以保持脂滴中的恒定荧光强度，从而实现脂滴的动态超分辨率成像。团队在Clog P的指导下，开发出四种不同颜色的缓冲脂滴探针，涵盖可见光谱范围。

活细胞的超分辨率荧光成像越来越需要能够进行多色和长时间动态成像的荧光探针，了解探针-靶标识别的机制对于此类探针的工程开发至关重要。脂滴作为细胞内脂质储存与能量代谢的核心细胞器，扮演着响应代谢需求、解读环境信号并维护细胞稳态的关键角色。它们不仅承载着脂质储备的基本功能，还广泛参与信号传导及多种疾病进程，其生物学重要性不言而喻。然而，可视化脂滴的动态行为面临挑战，主要是因为它们体积小、变化快、异质性强、在细胞环境中不可预测等。传统成像技术，通常难以实时可视化如此精细且动态的脂滴世界。这需要在纳米尺度上观察脂滴之间、脂滴与其他细胞器之间的相互作用，以及需要长期成像来探索完整的、以前未知的脂滴动态过程。因此，研发高性能脂滴荧光探针尤为重要，它们应兼具高灵敏度、卓越时空分辨率及抗光漂白的特性，以实现长期超分辨率成像。

针对以上挑战，研究团队提出了缓冲探针来解决超分辨率成像中的光漂白问题（ACS Sens.，2024；Anal. Chem. ，2024；Adv. Sci.，2024）：一旦目标结构内的探针发生光漂白，储存在附近的荧光探针就可以有效地取代漂白的探针，以确保稳定的荧光信号与长时间稳定的超分辨率成像。研究团队开发的脂滴缓冲荧光探针LD-FG解决了脂滴动态超分辨成像中的光漂白问题（Angew. Chem. Int. Ed.，2021），从而发现了脂滴各种动态过程，包括两种新的脂滴融合模式，以及不同细胞区域和不同细胞之间的异质性。

在此基础上，本研究利用Clog P引导开发多色的脂滴缓冲探针，并发现Clog P值在2.5至4之间的荧光染料对脂滴染色具有最优的缓冲能力。团队以Clog P为评价标准，系统地筛选了包括萘二甲酰亚胺、NBD、BODIPY衍生物等一系列荧光染料，发现了四种不同颜色的脂滴缓冲荧光探针，分别为LD-BFP405、LD-BFP450、LD-BFP488和LD-BFP543。这些探针具有中等脂溶性，可以实现脂滴的免洗成像，且具有较高的光稳定性，适用于多目标超分辨荧光成像。团队利用这些脂滴缓冲探针，使用结构化照明显微镜（SIM），追踪了脂滴动力学在细胞铁死亡过程中的作用，包括过表达的ACSL3蛋白的分泌、储存和降解。研究发现，在铁死亡期间，过表达的ACSL3蛋白可能以囊泡形式分泌到细胞质中，脂滴通过膜融合与这些囊泡相互作用，作为表达蛋白的储存位点。此外，这些蛋白质可能进一步与溶酶体等细胞器相互作用，或通过脂吞噬降解以维持细胞稳态。这些探针不仅增强了科研工作者可视化脂滴动态的能力，而且有望加深对细胞过程和疾病下脂滴生物学的理解。

相关研究成果以“Clog P-Guided Development of Multi-Colored Buffering Fluorescent Probes for Super-Resolution Imaging of Lipid Droplet Dynamics”为题，于近日发表在《先进科学》（Advanced Science）上。该工作的第一作者为我所1818组已毕业博士研究生陈婕，以上研究工作得到国家自然科学基金、我所创新基金等项目的支持。（文/图 乔庆龙、陈婕）

文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202408030